CNW 黄曲霉毒素 B1 免疫亲和柱 SBEQ-CC15001 在食品与饲料检测中的净化应用方案
上海仪器网 / 2025-09-30
一、方案背景与目的
黄曲霉毒素 B1（AFB1）作为强毒性真菌毒素，广泛污染花生、玉米、饲料等基质，其检测需精准规避基质干扰。CNW SBEQ-CC15001 免疫亲和柱采用AFB1 特异性抗体包被树脂，柱体积 3mL，可通过抗原 - 抗体特异性结合实现 AFB1 的高效富集与净化。本方案依据 GB 5009.22-2016 与 NY/T 2549-2014 标准，针对谷物、坚果、植物油脂及饲料等多基质样品，建立标准化净化流程，为后续 HPLC、荧光检测等提供低干扰样品，确保检测结果符合法规限值要求（如食品中 AFB1 限量≤5μg/kg）。
二、实验原理
SBEQ-CC15001 柱内免疫亲和树脂通过共价键固定 AFB1 单克隆抗体，当样品提取液过柱时，AFB1 与抗体特异性结合，而糖类、脂肪、色素等杂质随流出液弃去。经淋洗去除残留杂质后，用甲醇洗脱使抗体变性，AFB1 随洗脱液收集，实现 "特异性吸附 - 杂质去除 - 靶向洗脱" 的净化过程。该原理使柱体对 AFB1 的交叉反应率≤10%，柱容量≥30ng，满足高灵敏度检测需求。
三、实验材料与设备
1. 实验材料
- 样品：花生（粉碎过 20 目筛）、玉米粉、大豆油、配合饲料；
- 试剂：甲醇（色谱纯，用于洗脱）、乙腈（分析纯，用于提取）、0.1% 吐温 - 20 的 PBS 溶液（淋洗用）、超纯水（符合 GB/T 6682 二级标准）、AFB1 标准品（1000ng/mL）；
2. 实验设备
- 高速离心机（转速≥8000r/min）、涡旋振荡器、氮吹仪（37℃）、高效液相色谱仪（配荧光检测器）、电子天平（精度 0.1mg）。
四、实验操作流程
1. 样品前处理（分基质优化）
（1）谷物 / 坚果类（以花生为例）
- 称取 5.0g 粉碎样品于 50mL 离心管，加 25mL 乙腈 - 水（7:3，v/v），涡旋 3min，8000r/min 离心 10min；
- 取 10mL 上清液，加 20mL 超纯水稀释，经玻璃纤维滤膜过滤，收集滤液备用。
（2）植物油脂类（以大豆油为例）
- 称取 2.0g 样品于 50mL 离心管，加 10mL 正己烷涡旋溶解，再加 10mL 甲醇 - 水（7:3，v/v）萃取 2min；
- 8000r/min 离心 5min，取下层甲醇水溶液，加 10mL 超纯水稀释，过滤后备用。
（3）饲料类
- 称取 10.0g 饲料样品于 50mL 离心管，加 40mL 70% 甲醇溶液，涡旋 5min，8000r/min 离心 15min；
- 取 15mL 上清液，加 30mL 超纯水稀释，过滤后备用。
2. 免疫亲和柱净化（核心步骤）
- 柱活化：取出 SBEQ-CC15001 柱，恢复至室温（22-25℃），移除上下端塞子，弃去保存液至液面高于凝胶 3-5mm，连接 10mL 注射器；
- 上样：将上述滤液注入注射器，调节流速至 1-2 滴 / 秒，使液体缓慢过柱，弃去流出液（谷物 / 坚果样品上样 15mL，油脂样品上样 10mL）；
- 淋洗：谷物 / 油脂样品用 10mL 超纯水淋洗 2 次，饲料样品先用 10mL 0.1% 吐温 - 20 PBS 溶液冲洗，再用 10mL 超纯水淋洗 2 次，每次均弃去流出液；
- 吹干：通过真空装置向柱内压入空气，直至柱内凝胶完全吹干；
- 洗脱：加 1mL 甲醇至柱内，控制流速 2-3 秒 / 滴，收集全部洗脱液至离心管，37℃氮吹至近干，用甲醇复溶至 1mL，待检测。
3. 后续检测衔接
将复溶后的样品经 0.22μm 滤膜过滤，注入 HPLC 系统：色谱柱为 C18 柱（250mm×4.6mm），流动相为甲醇 - 水（60:40，v/v），流速 1.0mL/min，荧光检测器激发波长 365nm，发射波长 435nm，外标法定量。
五、关键注意事项
- 安全防护：AFB1 毒性极强，操作需戴乳胶手套、护目镜，在通风橱内进行；接触过毒素的容器需用 10% 次氯酸钠溶液浸泡 12h 以上；
- 流速控制：上样与洗脱流速需严格遵循 1-3 秒 / 滴，过快会导致抗体结合不充分或洗脱不完全，使回收率下降；
- 柱体维护：柱体需在 2-8℃保存，使用前恢复室温，避免温度骤变导致抗体失活；单次使用后按危废处理，不可重复使用；
- 基质适配：酱油、食醋等液体样品需额外用 0.1% 吐温 - 20 PBS 溶液预处理，减少基质黏附对净化的影响。
六、净化效果验证
- 回收率测试：向空白花生样品中添加 1.0μg/kg AFB1 标准品，经本方案处理后，回收率为 85%-95%，符合国标 GB 5009.22-2016 要求（70%-110%）；
- 纯度验证：对比净化前后 HPLC 色谱图，净化前样品基质峰（保留时间 2-4min）显著，AFB1 峰（保留时间 8.2min）被掩盖；净化后基质峰消失，AFB1 峰形对称，基线平稳；
- 灵敏度验证：对饲料样品检测的检出限为 0.3μg/kg，满足 NY/T 2549-2014 标准要求，可精准检测法规限量附近的样品。
