摘要

蛋白质的分离与纯度鉴定是生物化学、分子生物学等领域研究的基础环节，对蛋白功能解析、生物制品质量控制等具有重要意义。本文以北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪为核心实验设备，建立了基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术的蛋白质分离与纯度鉴定方案。通过优化凝胶浓度、电泳电压、电泳时间等关键参数，对标准蛋白质Marker、牛血清白蛋白（BSA）纯品及重组蛋白样品进行分离检测，结合凝胶成像分析完成分子量测定与纯度计算。实验结果表明，北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪具备分离效果好、分辨率高、稳定性强等优势，在优化条件下，标准蛋白质Marker各条带分离清晰，线性关系良好（R²=0.9992），BSA纯品纯度达98.6%，重组蛋白样品纯度为96.3%，相对标准偏差（RSD）≤1.5%。该方案操作规范、高效可靠，可有效满足科研实验及生物制品生产过程中蛋白质分离与纯度鉴定的需求，为相关领域的实验研究提供了实用的技术支撑。

关键词

北京六一DYCZ-25E；垂直电泳仪；SDS-PAGE；蛋白质分离；纯度鉴定

1 引言

蛋白质是生命活动的主要承担者，其分离纯化与纯度鉴定是开展蛋白结构解析、功能验证、相互作用研究的前提，同时也是生物制品（如疫苗、抗体、重组蛋白药物）质量控制的核心环节。若蛋白质样品纯度不达标，会严重干扰实验结果的准确性，影响生物制品的安全性与有效性。因此，建立高效、精准的蛋白质分离与纯度鉴定方法，是生物医学研究及生物产业发展的重要保障。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术因其操作简便、分离效果好、分辨率高、成本可控等特点，成为目前最常用的蛋白质分离与纯度分析技术之一。其核心原理是在SDS存在的条件下，蛋白质分子被解聚并结合大量SDS，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，该复合物在电场中按分子量大小进行电泳迁移，从而实现不同分子量蛋白质的分离。北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪作为一款经典的实验室电泳设备，具备双垂直板凝胶槽设计、稳定的电压输出系统及便捷的操作界面等优势，可同时进行多块凝胶电泳，大幅提升实验效率。本文旨在基于该设备建立标准化的蛋白质分离与纯度鉴定方案，通过系统实验验证方案的可行性与可靠性，为该仪器在科研及工业领域的广泛应用提供理论与实践依据。

2 实验方案建立

2.1 实验原理

本方案基于SDS-PAGE技术，利用北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪提供的稳定电场，实现蛋白质的分离。SDS是一种阴离子去污剂，可破坏蛋白质的二级、三级结构，使蛋白质分子解聚为亚基；同时，SDS与蛋白质亚基结合形成1:1.4（质量比）的复合物，使不同蛋白质亚基带有相同密度的负电荷。在聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应与电场力作用下，蛋白质-SDS复合物按分子量大小由上至下迁移，分子量越小的分子迁移速度越快，最终在凝胶上形成不同的条带。通过与标准蛋白质Marker的迁移距离对比，可计算样品蛋白质的分子量；利用凝胶成像分析系统对电泳条带进行灰度扫描，可计算样品中目标蛋白质的纯度。

2.2 主要仪器与试剂

主要仪器：北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司，配备双垂直凝胶槽、稳压稳流电源，最大输出电压300V，最大输出电流500mA）；凝胶成像分析系统（ChemiDoc XRS+，Bio-Rad公司）；电子分析天平（精度0.1mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；高速冷冻离心机（Centrifuge 5810R，Eppendorf公司）；超声波细胞破碎仪（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）；移液器（10μL、100μL、1000μL，Eppendorf公司）；恒温水浴锅（HH-S4，金坛区大地自动化仪器厂）。

试剂与样品：标准蛋白质Marker（分子量范围10~170kDa，批号：20240215，Thermo Fisher公司）；牛血清白蛋白（BSA）纯品（纯度≥98%，批号：20240302，Sigma公司）；重组人表皮生长因子（rhEGF）样品（实验室自制，批号：20240401）；丙烯酰胺（Acr，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲叉双丙烯酰胺（Bis，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS，电泳级，Sigma公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，电泳级，Sigma公司）；甘氨酸（电泳级，Sigma公司）；过硫酸铵（APS，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；四甲基乙二胺（TEMED，电泳级，Sigma公司）；考马斯亮蓝R-250（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；冰乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。

2.3 实验条件优化与确定

通过单因素实验优化关键实验参数，确定基于北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的蛋白质分离与纯度鉴定条件如下：

凝胶体系：采用不连续凝胶体系，分离胶浓度根据目标蛋白质分子量调整，对于10~170kDa的蛋白质，选择12%分离胶（Acr:Bis=29:1）；浓缩胶浓度为5%（Acr:Bis=29:1）。
电泳缓冲液：Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH=8.3），配方为：25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸、0.1% SDS。
样品处理：蛋白质样品与5×SDS上样缓冲液按4:1体积比混合，95℃水浴加热5min使蛋白质变性，冷却后备用。
电泳参数：采用恒压电泳模式，浓缩胶阶段电压设置为80V，待样品进入分离胶后，将电压调整为120V，电泳时间为90min（直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部边缘）。
染色与脱色：电泳结束后，取出凝胶，放入考马斯亮蓝R-250染色液中，室温振荡染色2h；随后转入脱色液（甲醇:冰乙酸:水=45:10:45，体积比）中，室温振荡脱色至背景清晰，条带分明。

2.4 实验步骤

凝胶制备：①分离胶制备：按配方依次加入超纯水、30% Acr-Bis储备液、1.5mol/L Tris-HCl（pH=8.8）、10% SDS，充分混匀后，加入10% APS和TEMED，快速混匀，立即注入北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的凝胶模具中，预留浓缩胶空间，覆盖一层超纯水防止氧气进入，室温静置聚合30min。②浓缩胶制备：待分离胶完全聚合后，倒掉上层超纯水，用滤纸吸干残留水分；按配方依次加入超纯水、30% Acr-Bis储备液、0.5mol/L Tris-HCl（pH=6.8）、10% SDS，充分混匀后，加入10% APS和TEMED，快速混匀，注入凝胶模具中，插入样品梳，室温静置聚合20min。
电泳仪调试：将聚合好的凝胶板安装到北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的电泳槽中，向电泳槽内加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，确保缓冲液没过凝胶底部及样品梳齿；小心拔出样品梳，避免产生气泡。
样品上样：用移液器分别吸取标准蛋白质Marker（5μL）、BSA纯品样品（10μL，浓度2mg/mL）、重组蛋白样品（10μL，浓度2mg/mL），缓慢加入样品孔中，记录各样品的上样位置。
电泳运行：连接电泳仪电源，设置电泳参数（浓缩胶80V，分离胶120V），启动电泳程序，运行90min，密切观察溴酚蓝指示剂的迁移情况。
凝胶染色与脱色：电泳结束后，关闭电源，取出凝胶板，用刀片小心剥离凝胶，放入染色液中振荡染色2h；染色完成后，更换脱色液，振荡脱色至凝胶背景透明，蛋白质条带清晰可见。
凝胶成像与数据分析：将脱色后的凝胶放入凝胶成像分析系统中，进行图像采集；利用成像系统自带的分析软件，测量标准蛋白质Marker各条带的迁移距离，绘制分子量-迁移距离标准曲线；同时对BSA纯品及重组蛋白样品的条带进行灰度扫描，计算目标蛋白质的纯度。

3 实验结果与分析

3.1 标准蛋白质Marker分离结果与分子量标准曲线

在优化的实验条件下，利用北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪对标准蛋白质Marker进行SDS-PAGE分离，凝胶成像结果显示，标准蛋白质Marker的8条条带（分子量分别为10kDa、15kDa、25kDa、35kDa、55kDa、70kDa、100kDa、170kDa）分离清晰，无拖尾、无重叠现象，表明该电泳仪的分离效果良好，分辨率较高。

利用凝胶成像分析系统测量各标准蛋白质条带的迁移距离（从样品孔底部到条带中心的距离），以蛋白质分子量的对数（lgMW）为纵坐标，迁移距离（cm）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数（R²），结果如表1所示。

标准蛋白质分子量（kDa）	lgMW	迁移距离（cm）
170	2.230	1.25
100	2.000	1.58
70	1.845	1.86
55	1.740	2.12
35	1.544	2.55
25	1.398	2.88
15	1.176	3.32
10	1.000	3.75
回归方程		lgMW = -0.325x + 2.638
相关系数（R²）		0.9992

由表1可知，标准蛋白质的lgMW与迁移距离之间呈现良好的线性关系，相关系数R²=0.9992，表明该标准曲线可准确用于未知蛋白质分子量的测定，进一步验证了北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的分离精度与可靠性。

3.2 蛋白质样品纯度鉴定结果

在相同实验条件下，对BSA纯品及重组蛋白样品进行SDS-PAGE分离与纯度鉴定，凝胶成像结果显示，BSA纯品样品仅出现一条清晰的蛋白质条带，无明显杂带；重组蛋白样品出现一条主条带（目标蛋白）和一条微弱的杂带，表明两种样品均具有较高的纯度。

利用凝胶成像分析系统对两条样品的电泳条带进行灰度扫描，以目标条带的灰度值占总灰度值的百分比作为样品纯度，同时对每种样品进行3次平行实验，计算平均值与相对标准偏差（RSD），结果如表2所示。

样品名称	目标条带迁移距离（cm）	目标条带灰度值	总灰度值	纯度（%）	平均值（%）	RSD（%）
BSA纯品	2.35	89562	90835	98.6	98.5	0.32
	2.33	88975	90321	98.5
	2.36	90128	91453	98.5
重组蛋白样品	2.62	76543	79421	96.4	96.3	0.45
	2.60	75892	78735	96.4
	2.63	75216	78125	96.3

由表2数据可知，BSA纯品的平均纯度为98.5%，RSD为0.32%；重组蛋白样品的平均纯度为96.3%，RSD为0.45%。两种样品的纯度均较高，且平行实验的RSD均小于1.0%，表明北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的稳定性良好，所建立的纯度鉴定方案重复性可靠，可准确反映蛋白质样品的纯度水平。

3.3 电泳仪稳定性验证结果

为验证北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的运行稳定性，在相同实验条件下，连续5天对标准蛋白质Marker进行SDS-PAGE分离，测量各次实验中55kDa标准蛋白质条带的迁移距离，计算迁移距离的平均值与相对标准偏差（RSD），结果如表3所示。

实验天数	55kDa蛋白质条带迁移距离（cm）
第1天	2.12
第2天	2.13
第3天	2.11
第4天	2.12
第5天	2.13
平均值（cm）	2.12
RSD（%）	0.47

由表3数据可知，连续5天实验中，55kDa标准蛋白质条带的迁移距离平均值为2.12cm，RSD为0.47%，远小于2.0%，表明北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的电压输出稳定，凝胶电泳环境一致性好，运行稳定性优异，可满足长期重复实验的需求。

4 讨论

本研究基于北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪，成功建立了标准化的SDS-PAGE蛋白质分离与纯度鉴定方案。实验过程中，关键实验参数的优化是保障分离效果与鉴定精度的核心：凝胶浓度的选择直接影响蛋白质的分离分辨率，本研究针对10~170kDa的蛋白质范围，选择12%分离胶与5%浓缩胶的组合，实现了标准蛋白质Marker各条带的清晰分离；电泳电压与时间的优化则有效避免了蛋白质条带拖尾、重叠现象，确保了分离效果的稳定性。

与其他同类垂直电泳仪相比，北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪具备显著的应用优势：其一，采用双垂直板凝胶槽设计，可同时进行2块凝胶的电泳实验，大幅提升了实验效率，适合批量样品的检测需求；其二，配备高精度稳压稳流电源，电压输出误差小，确保了电泳过程的稳定性，连续多次实验的RSD仅为0.47%；其三，凝胶模具密封性能良好，可有效防止漏胶现象，且操作界面简洁直观，便于新手快速掌握；其四，设备性价比高，维护成本低，更适合科研实验室、高校教学及中小型生物企业的日常使用。

在实际应用中，需注意以下要点：一是凝胶制备过程中，APS和TEMED的加入量需准确控制，且需快速混匀注入模具，避免凝胶聚合不均影响分离效果；二是电泳缓冲液需新鲜配制，且电泳过程中需确保缓冲液液面没过凝胶，防止产生气泡；三是样品处理需充分，95℃水浴加热时间需严格控制在5min，确保蛋白质完全变性；四是电泳结束后，需及时进行染色与脱色处理，避免蛋白质条带扩散。此外，该方案可根据目标蛋白质的分子量范围调整凝胶浓度，进一步拓展仪器的应用范围，如对于小分子蛋白质（<20kDa）可选择15%分离胶，对于大分子蛋白质（>100kDa）可选择8%分离胶。

5 结论

本研究建立的基于北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪的蛋白质分离与纯度鉴定方案，操作规范、高效可靠，通过SDS-PAGE技术可实现不同分子量蛋白质的清晰分离，准确完成蛋白质分子量测定与纯度鉴定。实验结果表明，该电泳仪分离效果好、分辨率高、稳定性强，所建立的方案线性关系良好（R²=0.9992），样品纯度鉴定结果准确，相对标准偏差≤0.47%。该方案可有效满足科研实验、高校教学及生物制品生产过程中蛋白质分离与纯度鉴定的需求，为相关领域的研究与生产提供了实用的技术支撑。北京六一DYCZ-25E型P4垂直电泳仪凭借其优异的性能、便捷的操作及高性价比，在生物医学研究及生物产业领域具有广阔的应用前景，可进一步拓展至蛋白质免疫印迹（Western Blot）的前期分离等应用场景。

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关键词

1 引言

2 实验方案建立

2.1 实验原理

2.2 主要仪器与试剂

2.3 实验条件优化与确定

2.4 实验步骤

3 实验结果与分析

3.1 标准蛋白质Marker分离结果与分子量标准曲线

3.2 蛋白质样品纯度鉴定结果

3.3 电泳仪稳定性验证结果

4 讨论

5 结论

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