一、引言

二、NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154核心参数与工作原理

2.1 核心技术参数

2.2 工作原理

三、NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154应用方案设计

3.1 应用场景与实验目标

• 建立基于NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154的生物样品前处理方法，实现对血浆、尿液样品中黄曲霉毒素B1、呕吐毒素的高效富集；
• 验证该方法的净化效果，有效去除样品中的蛋白质、脂质、有机酸等干扰物质，保障后续高效液相色谱（HPLC）检测的准确性；
• 对方法学性能进行验证，包括回收率、精密度、检出限、定量限等，评估该前处理方法的可靠性与适用性。

3.2 实验材料与仪器

3.2.1 实验材料

• 核心材料：NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154（规格：3 mL/100 mg，上海某生物科技有限公司）；
• 标准品：黄曲霉毒素B1标准品（纯度≥99.0%）、呕吐毒素标准品（纯度≥99.0%）；
• 生物样品：健康人血浆、尿液（经伦理审批后收集）；
• 试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、正己烷（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、甲酸（分析纯）、超纯水（18.2 MΩ·cm）；
• 其他：0.22 μm有机相滤膜、离心管（50 mL、1.5 mL）。

3.2.2 实验仪器

• 固相萃取装置（含真空抽滤系统）；
• 高效液相色谱仪（配荧光检测器、紫外检测器）；
• 高速冷冻离心机（GL-21C）；
• 电子分析天平（精度0.1 mg）；
• 涡旋振荡器；
• 氮吹仪。

3.3 具体实验方案

3.3.1 样品预处理

1. 血浆样品预处理：取1 mL血浆样品置于50 mL离心管中，加入3 mL乙腈，涡旋振荡2 min，充分沉淀蛋白质；随后以12000 r/min、4℃离心10 min，吸取上清液至另一离心管中，加入2 mL超纯水稀释，涡旋混匀，待上样；
2. 尿液样品预处理：取2 mL尿液样品置于50 mL离心管中，加入1 mL甲醇，涡旋振荡1 min，以8000 r/min、4℃离心5 min，吸取上清液，直接待上样（尿液基质相对简单，无需额外沉淀蛋白质）。

3.3.2 SPE小柱操作步骤（以3 mL/100 mg SBEQ-CA2154小柱为例）

1. 活化：向NH2氨基SPE小柱中加入3 mL甲醇，开启真空抽滤，控制流速为1 - 2 mL/min，待甲醇完全流尽；
2. 平衡：加入3 mL 0.05 mol/L乙酸铵缓冲液（pH=7.0），同样以1 - 2 mL/min流速流尽，平衡小柱填料至与样品基质兼容的pH环境；
3. 上样：将预处理后的血浆或尿液样品缓慢加入小柱中，控制流速1 mL/min，确保目标化合物充分吸附于填料上；
4. 淋洗：先加入3 mL正己烷，流尽后再加入3 mL 5%甲醇水溶液（V/V），依次淋洗小柱，去除脂质、残留蛋白质及部分酸性干扰物质；淋洗完成后，继续抽滤30 s，排尽小柱内残留液体；
5. 洗脱：加入3 mL含5%甲酸的乙腈溶液（V/V），以1 mL/min流速洗脱，收集洗脱液于1.5 mL离心管中；
6. 后续处理：将洗脱液置于氮吹仪中，40℃下氮吹至近干；加入1 mL甲醇复溶，涡旋振荡1 min，经0.22 μm有机相滤膜过滤后，供HPLC检测。

3.3.3 HPLC检测条件

• 色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
• 流动相：A相为0.05 mol/L乙酸铵缓冲液，B相为乙腈；梯度洗脱程序：0 - 5 min，30% B；5 - 15 min，30% - 60% B；15 - 20 min，60% B；20 - 25 min，60% - 30% B；
• 流速：1.0 mL/min；
• 柱温：30℃；
• 检测条件：黄曲霉毒素B1采用荧光检测器，激发波长365 nm，发射波长435 nm；呕吐毒素采用紫外检测器，检测波长220 nm；
• 进样量：20 μL。

3.3.4 方法学验证实验设计

• 回收率实验：向空白血浆、尿液样品中分别添加低、中、高三个浓度水平的黄曲霉毒素B1和呕吐毒素标准品（低浓度：黄曲霉毒素B1 0.5 μg/L、呕吐毒素5 μg/L；中浓度：黄曲霉毒素B1 2 μg/L、呕吐毒素20 μg/L；高浓度：黄曲霉毒素B1 10 μg/L、呕吐毒素100 μg/L），每个浓度水平设置6个平行样品，按上述实验方案处理并检测，计算加标回收率；
• 精密度实验：选取中浓度加标样品，连续6天进行前处理和检测（日间精密度），同一批样品中6个平行样同时处理检测（日内精密度），计算相对标准偏差（RSD）；
• 检出限（LOD）与定量限（LOQ）：对空白样品进行11次平行检测，以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限，以10倍信噪比（S/N=10）计算定量限。

四、实验结果与分析

4.1 净化效果验证结果

4.2 回收率实验结果

4.3 精密度实验结果

4.4 检出限与定量限结果

五、结论与建议

5.1 结论

• NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154对生物样品具有优异的净化效果，可有效去除血浆、尿液中的蛋白质、脂质、酸性干扰物质等，显著改善HPLC色谱图的基线稳定性和目标峰分离度，保障检测准确性；
• 该小柱对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素具有良好的富集性能，在低、中、高三个浓度水平下的加标回收率为85.2% - 96.4%，日内和日间精密度RSD均≤4.5%，方法学性能优异，符合生物样品分析要求；
• 方法检测灵敏度高，黄曲霉毒素B1检出限低至0.10 μg/L，呕吐毒素检出限低至1.0 μg/L，可满足生物样品中低浓度极性目标化合物的检测需求，适用于临床毒物检测、食品安全监测等领域的生物样品前处理工作。

5.2 建议

• 样品处理方面：上样前需确保样品充分离心，去除沉淀杂质，避免堵塞SPE小柱；对于粘度较大的生物样品（如血浆），可适当稀释后再上样，控制上样流速在1 mL/min左右，确保目标化合物充分吸附；
• 参数优化方面：针对不同类型的目标化合物（如不同极性的药物、毒素），应根据其化学性质优化淋洗液和洗脱液的种类及比例；对于复杂基质样品，可增加淋洗步骤或调整淋洗液体积，进一步提升净化效果；
• 设备与耗材使用方面：SPE小柱使用前需确保活化、平衡充分，避免因填料未完全活化影响吸附容量；实验过程中应使用配套的固相萃取装置，精准控制流速，保障实验重复性；
• 拓展应用方面：后续可探索NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154在其他生物样品（如组织匀浆、脑脊液）及其他极性目标化合物（如抗生素、农药残留）中的应用，进一步扩大其应用范围。