一、方案详情

1.1 方案目标

1.2 实验原理

1.3 实验仪器与试剂

1.3.1 仪器设备

• 核心设备：北京六一电脑三恒多用电泳仪电源DYY-6D（输出范围：电压10-300V，电流4-100mA，功率1-300W，具备恒压/恒流/恒功率切换功能，支持定时设置0-999min）；
• 联用设备：北京六一水平电泳槽DYCP-31BN（用于核酸电泳，凝胶面积120×100mm）、垂直电泳槽DYCZ-24DN（用于蛋白电泳，凝胶尺寸83×73mm）；
• 辅助设备：紫外凝胶成像系统（Bio-Rad ChemiDoc XRS+）、高速冷冻离心机（Eppendorf 5418R）、移液器（10μL/100μL/1000μL，Thermo）、电子天平（梅特勒ME204E，精度0.1mg）、恒温水浴锅（上海一恒HH-S4）；
• 样品处理设备：超声波细胞破碎仪（宁波新芝JY92-IIN）、核酸提取仪（天根DP304）。

1.3.2 试剂与材料

• 核酸实验试剂：琼脂糖（西班牙Biowest）、TAE电泳缓冲液（50×浓缩液，Solarbio）、核酸Marker（DL2000：100-2000bp；λ-Hind III：500-23130bp，Takara）、GoldView核酸染料（Solarbio）、质粒DNA（pET-28a，实验室保存）、小鼠肝脏基因组DNA（自行提取）；
• 蛋白实验试剂：丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、SDS（十二烷基硫酸钠）、Tris碱、甘氨酸、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250（均为Amresco）、蛋白Marker（10-180kDa，Thermo）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma）、HeLa细胞总蛋白（自行提取）；
• 其他材料：电泳级甲醇、冰乙酸（国药集团）、一次性手套、移液器吸头、离心管（1.5mL/50mL）、硝酸纤维素膜（GE）。

1.4 实验方法

1.4.1 样品制备

1. 核酸样品：①质粒DNA：通过碱裂解法提取后，用超纯水稀释至50ng/μL，-20℃保存；②基因组DNA：采用酚-氯仿法从小鼠肝脏组织中提取，经Nanodrop检测纯度（A260/A280=1.82），浓度调整为100ng/μL；③标准核酸Marker：DL2000用1×TAE缓冲液稀释至10ng/μL，λ-Hind III稀释至20ng/μL。
2. 蛋白样品：①BSA标准品：用蛋白上样缓冲液配制浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的梯度样品；②HeLa细胞总蛋白：通过RIPA裂解液提取，BCA法测定蛋白浓度为1.2mg/mL，加入上样缓冲液后95℃变性5min，-80℃保存；③蛋白Marker：直接加入上样缓冲液，无需稀释。

1.4.2 凝胶制备

• 核酸电泳凝胶：根据分离需求制备不同浓度琼脂糖凝胶，①小片段核酸（100-2000bp）：1.5%琼脂糖凝胶，加入GoldView染料（终浓度1×）；②大片段基因组DNA（500-23130bp）：0.8%琼脂糖凝胶，染料添加同前，凝胶凝固后备用。
• 蛋白电泳凝胶：制备SDS-PAGE凝胶，①分离胶（12%）：Acr/Bis（30%）4mL、Tris-HCl（1.5M，pH8.8）2.5mL、10%SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL，加超纯水补至10mL；②浓缩胶（5%）：Acr/Bis（30%）0.67mL、Tris-HCl（0.5M，pH6.8）1.25mL、10%SDS 0.05mL、10%过硫酸铵0.05mL、TEMED 0.005mL，加超纯水补至5mL。

1.4.3 电泳参数优化实验设计

• 核酸电泳（以1.5%琼脂糖凝胶分离DL2000为例）：A因素（电压）：A1（80V）、A2（120V）、A3（160V）；B因素（电流）：B1（30mA）、B2（50mA）、B3（70mA）；C因素（电泳时间）：C1（30min）、C2（45min）、C3（60min）。
• 蛋白电泳（以12%SDS-PAGE分离HeLa蛋白为例）：A因素（电压-浓缩胶）：A1（60V）、A2（80V）、A3（100V）；B因素（电压-分离胶）：B1（100V）、B2（120V）、B3（150V）；C因素（电泳时间）：C1（60min）、C2（80min）、C3（100min）。

1.4.4 电泳操作流程

1. 仪器连接：将DYY-6D电源与对应电泳槽连接，确保正负极对应正确（核酸/蛋白电泳均为样品孔靠近负极），开启电源，进入参数设置界面。
2. 参数设置：根据样品类型选择“恒压”模式（优先推荐，确保分离稳定），输入优化后的电压、电流上限及电泳时间参数，启动电泳。
3. 样品上样与检测：①核酸电泳：每孔上样量10μL（含样品5μL+上样缓冲液5μL），电泳结束后置于紫外凝胶成像系统下观察并拍照；②蛋白电泳：每孔上样量20μL，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色2h，脱色液脱色至条带清晰，再进行成像分析。
4. 性能验证：在最优参数下，对同一样品进行6次平行电泳验证重复性；连续5天进行标准Marker电泳，验证电源长期稳定性；通过条带迁移距离与Marker对比，计算核酸片段大小及蛋白分子量。

1.4.5 评价指标计算方法

• 分辨率（R）：核酸电泳中R=2×(d2-d1)/(W1+W2)，其中d为条带中心到上样孔的距离，W为条带宽度；蛋白电泳中R计算方法相同，反映条带分离清晰度。
• 相对标准偏差（RSD）：用于评价重复性，RSD=（标准偏差/测量值平均值）×100%，测量值包括条带迁移距离、灰度值。
• 迁移速率（V）：V=迁移距离/电泳时间，单位为mm/min，反映分离效率。
• 分子量偏差率（RE）：蛋白实验中，RE=|计算分子量-标准分子量|/标准分子量×100%，评价分子量测定准确性。

1.5 实验结果与数据分析

1.5.1 最优电泳参数确定