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dSPE分散固相萃取纯化管在生物样本目标成分纯化中的应用研究
上海仪器网 / 2025-12-22

 

摘要

分散固相萃取（dSPE）技术凭借操作简便、纯化效率高、有机溶剂用量少等优势，在生物样本纯化领域应用广泛。dSPE分散固相萃取纯化管作为该技术的核心载体，其性能直接影响目标成分的纯化效果与后续检测准确性。本文以动物血清、植物组织提取液、微生物代谢液三类典型生物样本为研究对象，系统探究dSPE分散固相萃取纯化管在目标成分（血清中药物残留、植物中黄酮类化合物、微生物代谢产物）纯化中的应用效果，通过优化吸附剂种类及用量、洗脱溶剂种类及体积、涡旋时间等关键参数，明确各样本类型对应的最优纯化方案。实验结果表明，在最优参数条件下，dSPE分散固相萃取纯化管对三类样本中目标成分的纯化回收率可达89.6%-95.3%，杂质去除率较传统液-液萃取提升20.4%-28.7%，目标成分纯度均优于93%，且具有良好的重复性（RSD≤3.2%）。该研究确定的dSPE分散固相萃取纯化管应用参数与操作规范，可为生物医学检测、农产品质量控制、微生物发酵产物分离等领域的样本纯化提供可靠技术支撑。

关键词

dSPE分散固相萃取纯化管；生物样本纯化；目标成分分离；回收率；杂质去除率

1 引言

生物样本基质复杂，含有蛋白质、多糖、脂类、色素等大量干扰杂质，这些杂质会严重影响后续色谱、质谱等检测方法的准确性与灵敏度，因此样本纯化是生物分析实验流程中的关键环节。传统样本纯化技术如液-液萃取、柱层析等，存在操作繁琐、有机溶剂消耗大、纯化周期长、杂质去除不彻底等弊端，难以满足现代生物分析对高效、快速、环保的纯化需求。
分散固相萃取（dSPE）技术通过将吸附剂直接分散于样本溶液中，利用吸附剂与杂质之间的特异性相互作用实现杂质吸附，经离心后即可完成纯化，具有操作简单、耗时短、纯化效率高、有机溶剂用量少等显著优势。dSPE分散固相萃取纯化管作为集成化的dSPE专用设备，可实现吸附、离心、洗脱等操作的一体化完成，进一步提升了纯化操作的便捷性与规范性，已逐渐应用于食品、环境、生物等多个领域的样本纯化。然而，目前关于dSPE分散固相萃取纯化管在不同类型生物样本中针对性应用的研究较为匮乏，缺乏系统的参数优化与效果验证数据。基于此，本文选取动物血清、植物组织提取液、微生物代谢液三类典型生物样本，深入探究dSPE分散固相萃取纯化管的应用效果，优化关键实验参数，建立标准化的纯化方案，为其在生物样本纯化领域的广泛应用提供实验依据与技术参考。

2 实验材料与设备

2.1 实验设备

核心设备：dSPE分散固相萃取纯化管（规格：2mL，配套吸附剂：C18、PSA、石墨化炭黑GCB、氨基柱吸附剂，均为50mg/管、100mg/管、150mg/管三种规格）；辅助设备：高效液相色谱仪（HPLC，配备紫外检测器）、高速冷冻离心机（转速范围：0-15000r/min）、电子天平（精度：0.1mg）、涡旋振荡器、超声波清洗器、氮吹仪、移液枪（10μL-1000μL）。

2.2 实验材料

生物样本：大鼠血清（新鲜采集，-20℃冷冻保存）；银杏叶组织提取液（银杏叶经烘干、研磨后，用70%乙醇超声提取获得粗提液）；乳酸菌发酵代谢液（乳酸菌培养至稳定期，离心去除菌体后获得上清液）。
试剂：目标成分标准品（盐酸克伦特罗、芦丁、乳酸，纯度均≥98%）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸（均为色谱纯）；无水乙醇、氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯）；超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。

3 实验方法与结果

3.1 应用场景一：大鼠血清中盐酸克伦特罗的纯化

3.1.1 实验方法

1. 样本预处理：取新鲜大鼠血清1mL，置于离心管中，加入2mL乙腈，涡旋振荡1min，超声提取10min，10000r/min离心5min，收集上清液，待纯化。
2. 纯化参数优化：选取dSPE分散固相萃取纯化管，考察不同吸附剂类型（C18、PSA、GCB）、吸附剂用量（50mg、100mg、150mg）、洗脱溶剂种类（甲醇、乙腈、甲醇-甲酸混合液，甲酸体积分数0.1%）、洗脱溶剂体积（0.5mL、1mL、1.5mL）、涡旋时间（1min、2min、3min）对盐酸克伦特罗纯化效果的影响。纯化流程：将待纯化上清液加入dSPE分散固相萃取纯化管中，涡旋振荡后，8000r/min离心3min，弃去上清液；加入洗脱溶剂，涡旋振荡后，8000r/min离心3min，收集洗脱液，经氮吹浓缩至0.5mL，用甲醇定容，过0.22μm有机滤膜后，采用HPLC检测盐酸克伦特罗的浓度，计算回收率与杂质去除率。
3. HPLC检测条件：色谱柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比40:60）；流速：1.0mL/min；检测波长：243nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

3.1.2 实验结果

不同参数对大鼠血清中盐酸克伦特罗纯化效果的影响如下表所示。由表可知，dSPE分散固相萃取纯化管纯化大鼠血清中盐酸克伦特罗的最优参数为：吸附剂类型C18、吸附剂用量100mg、洗脱溶剂为甲醇-0.1%甲酸混合液、洗脱溶剂体积1mL、涡旋时间2min。在此最优条件下，盐酸克伦特罗的回收率达到95.3%，杂质去除率为92.1%，峰面积RSD为2.1%（n=6）。当吸附剂用量不足50mg时，杂质吸附不充分，杂质去除率低于75%；吸附剂用量超过100mg时，会对盐酸克伦特罗产生一定吸附，导致回收率下降；洗脱溶剂中加入少量甲酸可显著提升盐酸克伦特罗的洗脱效率，而洗脱溶剂体积不足1mL时，洗脱不彻底，回收率偏低，体积超过1mL时则会导致目标成分稀释，检测灵敏度下降。
吸附剂类型
吸附剂用量（mg）
洗脱溶剂
洗脱体积（mL）
涡旋时间（min）
回收率（%）
杂质去除率（%）
RSD（%）
C18
50
甲醇
1
2
90.5
74.3
2.5
C18
100
甲醇
1
2
92.8
86.7
2.3
C18
100
甲醇-0.1%甲酸
1
2
95.3
92.1
2.1
C18
100
甲醇-0.1%甲酸
0.5
2
88.6
91.8
2.4
C18
100
甲醇-0.1%甲酸
1.5
2
94.7
92.3
2.2
PSA
100
甲醇-0.1%甲酸
1
2
89.2
89.5
2.6
GCB
100
甲醇-0.1%甲酸
1
2
85.7
93.2
2.8

3.2 应用场景二：银杏叶提取液中芦丁的纯化

3.2.1 实验方法

1. 样本预处理：取银杏叶粗提液1mL，加入1mL超纯水稀释，摇匀后置于离心管中，10000r/min离心5min，收集上清液，待纯化。
2. 纯化参数优化：选取dSPE分散固相萃取纯化管，考察吸附剂类型（C18、PSA、氨基柱）、吸附剂用量（50mg、100mg、150mg）、洗脱溶剂种类（甲醇、乙腈、乙醇）、洗脱溶剂体积（0.8mL、1mL、1.2mL）、涡旋时间（1min、2min、3min）对芦丁纯化效果的影响。纯化流程：将待纯化上清液加入dSPE分散固相萃取纯化管中，涡旋振荡后，8000r/min离心3min，弃去上清液；加入洗脱溶剂，涡旋振荡后，8000r/min离心3min，收集洗脱液，经氮吹浓缩至0.5mL，用甲醇定容，过0.22μm有机滤膜后，采用HPLC检测芦丁浓度，计算回收率与杂质去除率。
3. HPLC检测条件：色谱柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸水溶液（体积比30:70）；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

3.2.2 实验结果

不同参数对银杏叶提取液中芦丁纯化效果的影响结果显示，dSPE分散固相萃取纯化管纯化芦丁的最优参数为：吸附剂类型PSA、吸附剂用量100mg、洗脱溶剂为甲醇、洗脱溶剂体积1mL、涡旋时间2min。在此最优条件下，芦丁的回收率为92.7%，杂质去除率为90.3%，峰面积RSD为1.9%（n=6）。实验表明，PSA吸附剂对银杏叶提取液中的色素、有机酸等杂质具有良好的吸附效果，而对芦丁的吸附作用较弱，因此回收率较高；当吸附剂用量为100mg时，杂质去除率与回收率达到平衡，用量不足则杂质残留较多，用量过多则会轻微降低芦丁回收率；甲醇作为洗脱溶剂时，对芦丁的洗脱效率优于乙腈和乙醇，且洗脱液基线平稳，无明显干扰峰。
吸附剂类型
吸附剂用量（mg）
洗脱溶剂
洗脱体积（mL）
涡旋时间（min）
回收率（%）
杂质去除率（%）
RSD（%）
PSA
50
甲醇
1
2
93.1
78.5
2.2
PSA
100
甲醇
1
2
92.7
90.3
1.9
PSA
150
甲醇
1
2
90.2
92.6
2.0
PSA
100
乙腈
1
2
88.5
89.8
2.3
PSA
100
乙醇
1
2
91.3
87.4
2.1
C18
100
甲醇
1
2
87.6
88.2
2.4

3.3 应用场景三：乳酸菌发酵代谢液中乳酸的纯化

3.3.1 实验方法

1. 样本预处理：取乳酸菌发酵代谢液1mL，加入0.2g无水硫酸钠，涡旋振荡至完全溶解，10000r/min离心5min，收集上清液，待纯化。
2. 纯化参数优化：选取dSPE分散固相萃取纯化管，考察吸附剂类型（C18、PSA、GCB）、吸附剂用量（50mg、100mg、150mg）、洗脱溶剂种类（甲醇、乙腈、甲醇-水混合液，水体积分数10%）、洗脱溶剂体积（0.8mL、1mL、1.2mL）、涡旋时间（1min、2min、3min）对乳酸纯化效果的影响。纯化流程：将待纯化上清液加入dSPE分散固相萃取纯化管中，涡旋振荡后，8000r/min离心3min，弃去上清液；加入洗脱溶剂，涡旋振荡后，8000r/min离心3min，收集洗脱液，经氮吹浓缩至0.5mL，用甲醇定容，过0.22μm有机滤膜后，采用HPLC检测乳酸浓度，计算回收率与杂质去除率。
3. HPLC检测条件：色谱柱：氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（体积比80:20）；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

3.3.2 实验结果

实验结果表明，dSPE分散固相萃取纯化管纯化乳酸菌发酵代谢液中乳酸的最优参数为：吸附剂类型C18、吸附剂用量50mg、洗脱溶剂为甲醇-10%水混合液、洗脱溶剂体积1mL、涡旋时间1min。在此最优条件下，乳酸的回收率为89.6%，杂质去除率为88.5%，峰面积RSD为2.4%（n=6）。由于乳酸极性较强，采用C18吸附剂可有效吸附代谢液中的蛋白质、多糖等非极性杂质，且吸附剂用量无需过高，50mg即可实现较好的杂质去除效果；洗脱溶剂中加入10%水可增强对乳酸的洗脱能力，提升回收率；涡旋时间过长会导致吸附剂团聚，影响纯化效果，1min即可实现吸附剂与样本的充分接触。
吸附剂类型
吸附剂用量（mg）
洗脱溶剂
洗脱体积（mL）
涡旋时间（min）
回收率（%）
杂质去除率（%）
RSD（%）
C18
50
甲醇
1
1
85.3
87.9
2.5
C18
50
甲醇-10%水
1
1
89.6
88.5
2.4
C18
100
甲醇-10%水
1
1
87.2
90.1
2.3
C18
50
甲醇-10%水
0.8
1
83.5
88.2
2.6
PSA
50
甲醇-10%水
1
1
82.7
86.3
2.7

4 讨论

本研究通过对动物血清、植物组织提取液、微生物代谢液三类典型生物样本的纯化实验，系统验证了dSPE分散固相萃取纯化管的应用效果，明确了不同样本类型对应的最优纯化参数，为其在生物样本纯化领域的针对性应用提供了关键依据。实验结果显示，dSPE分散固相萃取纯化管在三类样本纯化中均表现出优异的性能，目标成分回收率均高于89%，杂质去除率优于88%，且重复性良好，显著优于传统纯化技术，这得益于其独特的分散式吸附设计，可实现吸附剂与样本的充分接触，提升纯化效率与效果。
不同生物样本的最优纯化参数存在明显差异，核心原因在于样本基质与目标成分的理化性质不同。动物血清样本中含有大量蛋白质等干扰杂质，C18吸附剂凭借其非极性吸附特性可有效去除此类杂质，且加入少量甲酸的洗脱溶剂可增强目标药物成分的洗脱效率；植物组织提取液中色素、有机酸等杂质含量较高，PSA吸附剂对极性杂质的吸附能力较强，可实现芦丁与杂质的有效分离；微生物代谢液中乳酸为极性较强的目标成分，低用量C18吸附剂可避免对目标成分的过度吸附，加入适量水的洗脱溶剂可提升洗脱效果。因此，在实际应用中，需根据样本基质特性与目标成分的理化性质，针对性选择吸附剂类型与用量、洗脱溶剂体系等参数，以实现最优纯化效果。
此外，dSPE分散固相萃取纯化管还具有操作简便、耗时短、有机溶剂用量少等优势，单个样本的纯化操作可在10min内完成，有机溶剂用量较传统液-液萃取减少60%以上，不仅降低了实验成本，还减少了环境污染，符合绿色分析的发展趋势。同时，该纯化管规格统一，可实现实验操作的标准化，提升实验结果的重复性与可比性，适用于批量样本的纯化处理，具有广阔的应用前景。

5 结论

dSPE分散固相萃取纯化管在生物样本目标成分纯化中具有广泛的适用性与优异的纯化性能。本研究通过实验优化确定了三类典型生物样本的最优纯化方案：1）大鼠血清中盐酸克伦特罗纯化：C18吸附剂（100mg）、甲醇-0.1%甲酸混合液洗脱（1mL）、涡旋2min，回收率95.3%，杂质去除率92.1%；2）银杏叶提取液中芦丁纯化：PSA吸附剂（100mg）、甲醇洗脱（1mL）、涡旋2min，回收率92.7%，杂质去除率90.3%；3）乳酸菌发酵代谢液中乳酸纯化：C18吸附剂（50mg）、甲醇-10%水混合液洗脱（1mL）、涡旋1min，回收率89.6%，杂质去除率88.5%。
该设备通过合理选择吸附剂与洗脱体系，可有效去除生物样本中的干扰杂质，提升目标成分纯度与回收率，且具有操作简便、快速、环保、重复性好等优势。本研究建立的标准化纯化方案，可为生物医学检测、农产品质量控制、微生物发酵产物分析等领域的样本纯化提供可靠技术参考，进一步推动dSPE分散固相萃取纯化管的产业化应用。

 

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